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1,配制兩個100ul PCR反應混合液來消化scFV文庫,其中1個用于VH-VκscFv文庫,另1個用于VH-Vλ scFv文庫,該混合液含有:
●scFV DNA(1~4ug),50ul
●水,33ul
●10×NEB 3緩沖液,10ul
●乙酰BSA(100×),1.0ul
●Nco工(10U/ul),3.0f11
●NoJ工(10U/ul),3.0ul
2.37℃孵育反應液過夜。要用37℃孵育箱或者有加熱蓋的加熱裝置,防止水分蒸發?;蛘?,可以按PCR反應那樣加一層礦物油(Sigma)。
3.用1%瓊脂糖膠純化基因文庫,并用Geneclean試劑盒提取DNA。重懸產物于30ul水中。在1%瓊脂糖凝膠中,與已知大小和濃度的標準對照品比較,測定DNA濃度。
4.消化4ug氯化銫純化的pHENl DNA以準備載體,其過程*如上述消化scFv基因文庫的流程,但須將scFvDNA替換為質粒DNA②。
5.用0.8%瓊脂糖膠純化已消化的載體DNA,再按處理scFv插入序列的方式,用Gene-clean自膠中提取載體片段。將產物重懸于30ul水中。在1%瓊脂糖凝膠中,與已知大小和濃度的標準對照品比較,測定DNA濃度。
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