Colony hybridization重組質體的檢定

方法步驟：
1） 前一天轉形的培養皿，當菌落長至約0.5 mm 大小時，將培養皿移至4℃放置1 h。
2） 準備一張無菌的硝化纖維濾膜，以鉛筆在邊緣標上組別。
◆ 請戴手套后再拿取濾膜！
3） 打開培養皿蓋子，以兩支扁平鑷子將濾膜兩邊夾住，輕輕覆蓋在菌落上方，盡可能避免有氣泡產生。
◆ 注意！濾膜覆蓋上去后就不要再移動！
4） 等濾膜*濕透后，以針頭在濾膜邊緣戳洞做記號 （至少做三個記號）。小心把濾膜掀起，菌落朝上放置在LB/Amp/IPTG plate 上。蓋上蓋子，在37℃培養2~4 h，以誘導啟動T5 promoter，表現其下游基因。原培養皿則置回37℃使菌落再長出。
5） 將培養皿蓋子打開，培養皿移至充滿chloroform 蒸氣的干燥器中，置放30min。
6） 取一個空petri dish 或適當大小容器，加入20 mL lysis buffer。 把已經過chloroform 溶菌的濾膜浸入lysis buffer，在室溫震蕩30 min。
7） 將濾膜以PBS 浸洗搖蕩10 min，再更換PBS 繼續浸洗10 min。
8） 將濾膜浸于明膠NET 溶液中，室溫搖蕩1 h。
9） 濾膜以PBST 浸洗兩次，每次10 min。
10） 一次抗體以明膠NET 溶液適當稀釋，再將濾膜浸入，于室溫搖蕩1 h。
11） 濾膜以PBST 浸洗兩次，繼以PBS 浸洗一次，每次10 min。
12） 將濾膜置于二次抗體溶液中 （以明膠NET 稀釋），于室溫搖蕩1 h。
13） 濾膜以PBST 浸洗兩次，繼以PBS 浸洗一次，每次10 min。
14） 以DAB 溶液進行呈色反應。觀察呈色情形，當訊號可明顯與背景區別時，將濾膜以水浸洗數次，以中止呈色反應。
15） 將濾膜置于濾紙或吸水紙上干燥后與原培養皿對照，標出有正反應的菌落位置。濾膜以膠膜護貝，避光貯存。
16） 選取數個正反應菌落，以劃單一菌落的方式分別接種在LB/Amp plate 上，置37℃培養直至菌落長出。亦同時接種于3 mL LB/Amp 培養液，于37℃震蕩培養過夜，以抽取質體，進行限制酶分析。

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