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News Center[方法]1.用無菌塑料吸嘴挑取一個AmpR噬菌粒菌落(直徑大約lmm)并將其轉入到0.2mlMicroAmp反應管中,內含20u1洗脫緩沖液。在GeneAmp9600PCR儀中,95℃加熱樣本10分鐘(避免用離心澄清,因為加熱可使細胞碎片黏附在管底)。2.將菌落提取物作為該克隆的主拷貝保存。另外,這些菌落也可以直接轉移到PCR反應體系中,并在PCR程序中插入加熱步驟。此時,可將克隆主拷貝穿刺接種到在用UV滅菌并鋪有LB—瓊脂培養基+Amp的微板孔中。3.配置PCR反應體系:將...
CAS號:3844-53-9中文名稱:L-賴氨酸乙酯二鹽酸鹽其他中文名稱:英文名稱:H-Lys-OEt?2HCl其他英文名稱:L-Lysineethylesterdihydrochloride產品規格:特純英文名稱:H-Lys-OEt·2HCl;L-LysineethylesterdihydrochlorideCAS號:3844-53-9C8H18N2O2·2HC1=247.17的別:Purum含量:≥98.0%熔點:145℃比旋光度:+10±1°(c=2%in...
1.通過腹腔注射濃度為1.25%(w/v)的阿佛丁來麻醉小鼠。2.打開胸腔并暴露心臟。3.用10ml的DMEM或PBS來灌注小鼠。4.連同一個或多個對照器官一起,取出要研究的器官和組織,并將其置于一個直徑為30m的細胞培養皿中。5.用無菌刀片將每個器官或組織都切碎。6.將切碎的器官或組織放到2.2m1的無菌塑料管中,并加入1.8m10.5mg/m1的膠原酶?;靹虿⒃?7℃搖瓶孵育30分鐘。在37℃培養時,持續搖動樣品。7.以1500r/min的速率短暫離心細胞懸液5分鐘,并棄...
pG6質粒是噬菌體顆粒載體,是為融合蛋白的單價展示設計的。來自輔助噬菌體的野生型pⅥ與噬菌體顆粒載體表達的pⅥ-cDNA的融合蛋白競爭合成原始的噬菌體顆粒。在多鏈接區域除了有一個額外的SalI位點以外,實際上噬菌體顆粒載體pG6A、pG6B、pG6C與載體pDONG6是等同的,pDONG6允許在gⅥ的3’末端進行eDNA文庫克隆。從lac啟動子轉錄可以產生雙側順反子mRNA:*條順反子在lacZ和gⅢ3’末端之間編碼一個融合蛋白,而第二條順反子包含了gⅥ-eDNA融合基因。g...
[方法]A.PCR擴增cDNA插入片段1.在冰浴中將以下成分加到0.2m1微量離心管中(執行10步反應)●水,36.5ul●10×Pfu緩沖液,5.0ul●10mmol/LdNTP,1.5ul●λGTll正向引物(10umol/L),2.5ul●λGTll反向引物(10umol/L),2.5ul●已制備好的Sfi-NotIλGTllcDNA文庫,1.Oul●PfuDNA聚合酶(2.5U/ul),1.0ul2.混合反應物并用50ul的礦物油覆蓋。3.在95℃下使模板變性2分鐘,...
[方法]1.收集新鮮人血液并立即用Ficoll分離白細胞。2.用冰冷PBS洗滌外周血淋巴細胞3次。3.在50ml塑料離心管中收集外周血淋巴細胞,并加入7ml裂解緩沖液(可溶解達到5×108個外周血淋巴細胞),然后劇烈渦旋振蕩以溶解細胞。4.加入7體積(49m1)4m01/L氯化鋰,4℃孵育15~20小時(過夜)。5.將懸液轉移到30mlCorex管內,在吊桶式轉頭內4℃離心2小時,6500r/min。6.棄去上清,并用Kimwipe擦拭試管口。用3mol/L氯化鋰(大約15m...
[方法]1.為合成cDNA*鏈,在1個1.5ml硅化微量離心管中制備以下反應混合液,●10-RT緩沖液,5ul●20×dNTP,5ul●100mmol/LDTT,5ul●HuIgMFOR引物,2ul●HuCκFOR引物,2ul●HuCλFOR引物,2ul●RNAsin,80U(2ul)●所有引物濃度均為10pmol/ul2.取整數體積(1~4ug)存于乙醇中的RNA,放在1個無菌1.5ml微量離心管內,并用微型離心機離心5分鐘。用70%乙醇洗滌沉淀1次,晾干,并用24.5ul...
[器材和試劑]●T4DNA連接酶及10×緩沖液(NEB)●酚/氯仿(Sigma)●100%和70%乙醇,-20℃保存●消化的載體和scFv文庫●TE(10mmol/LTrispH8,lmmol/LEDTA)[方法]1.如下所述,配制兩個100ul連接混合液,其中1個用于VH-VκscFv文庫,另1個用于Vu-VλscFv文庫,并設置兩個對照反應。對照可以確定未切的載體有多少(對照2),以及確定無插入序列時有多少重新連接的載體(對照1)。要保持恰當的比例,所獲得的克隆數(對于相...