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方法步驟：1）尿素洗過夜的轉印紙再以10mLPBST洗三次，每次約10min，均在上述方形培養皿中進行。2）轉印紙放在明膠NET溶液中反應，置室溫中反應1h。一般使用方形培養皿當容器，但亦可裝入塑料袋中反應，較節省試劑用量。3）反應后，以PBST浸洗二次。4）把轉印紙放在抗體溶液中反應，置室溫反應1h。5）反應后以PBST洗三次，改用酶聯體反應，在室溫下反應1h。6）以PBST洗四至五次，注意容器也要洗干凈。7）加入DAB基質溶液約10mL呈色，盡量避光，并且不時搖動呈色液。...
[方法]1．配制4個50ulPCR反應混合液，包含：●去離子水，35．5ul●20×dNTP（每種5mmol/L），2．5ul●10×Vent聚合酶緩沖液，5．0ul●LMB3引物（10pmol/ul），2．5ul●VL—NotI引物（10pmol/ul），2．5ul●scFV基因模板DNA（100ng），1ul●VentDNA聚合酶（2單位），1．0ul2．在有加熱蓋的熱循環儀內，加熱反應混合液到94℃5分鐘。3．以94℃1分鐘、42℃1分鐘、72℃2分鐘的條件共循環30次...
[方法]1．配制1個50ul連接混合液，包含：●10×連接緩沖液，5uI●水，16ul●NcoI和NotI消化的pHENl（100g／ul），20ul●VcoI和NotI消化的scFv文庫（100g/ul）,7ul●T4DNA連接酶（400U／ul），2ul2．16℃孵育反應液過夜。3．乙醇沉淀DNA并用70％乙醇洗滌沉淀1次。4．重懸DNA于10ul水中。5．用4份相同的2．5ul的DNA分別電轉化到電感受態大腸桿菌TGl細胞中。6．確定文庫容量，并將菌文庫材抖儲存于-70...
[方法]1．每個克隆用lml2XTY／amp／S1u30~C培養過夜，250r／min振蕩。2．取50u1過夜培養物，加入到含有5ml2XTY／amp／0．1％glu的50ml試管內；并在30℃培養大約2小時，250r／Illin振蕩，吸光度（A600）大約0．9。3．每管加入2．5ullmol／LIPTG誘導scFv表達（終濃度為500umol／L），并在30℃培養4h，250r／min振蕩。在1個15mlFalcon試管內4000g離心15分鐘，收集細胞。4．準備外周質提...
免疫組織化學（1HC）或稱免疫細胞化學是一種方法學，根據特異性抗原—抗體反應的原理，檢測組織或細胞內的抗原或抗體成分。IHC有一個很長的發展歷史，已有半個世紀以上，自Coons創建免疫熒光組化技術以來，不斷有人（或公司）推出更為敏感的方法，經過60多年的不斷努力和發展，由zui初的免疫熒光直接標記法，逐步出現了間接法、免疫酶法、親和細胞化學方法、免疫膠體金法，多聚物酶法（或稱非生物素放大法）、CSA法、原位免疫PCR法及循環放大法等。目前提高免疫組化敏感性可通過如下幾種途徑來...
①膠體金溶液可以重復制備，其顆粒大小可以控制，可較容易進行免疫電鏡的雙重或多重標記；②金標探針有很高的電子密度，有特殊的分辨率，定位準確；③金標探針能發射二次電子和反射電子，是掃描電鏡目前的標記物；④金標探針與組織細胞內的抗原結合后，可用銀增強，大大提高了IHC的敏感性，是目前zui為敏感的IHC方法之一；⑤免疫金銀染色方法無致癌性，使用較安全。膠體金技術是以膠體金作為一種標記物。膠體金是指金的水溶膠，它具有一般溶膠的特性。溶膠是指一種物質以或大或小的微小粒子分散在另一種物質...
（一）膠體金的顏色溶膠的顏色取決于分散相物質的顏色、分散相物質的分散度和入射光線的種類，是散射光線還是透射光，粒子越小，分散度越高，則散射光的波長越短。對同一種物質的水溶膠來說，粒子大小不同，呈現的顏色亦不同。如膠體金顆粒在5～20nm之間，吸收波長520nm，呈紅色的葡萄酒色；20～40nm之間的金溶膠主要吸收波長530nm的綠色光，溶液呈深紅色；60nm的膠體金溶膠主要吸收波長600nm的橙黃色光，溶液呈藍紫色。一般應用于免疫組織化學的膠體金顆粒為5～60nm范圍內，溶液...
[方法]1．建立以下連接反應：●載體DNA（pG6AppG6B，pG6C）（10ug）xul●cDNA片段（3～5ug）yul●10×連接緩沖液40ul●T4DNA連接酶（6WeissU/ul）5ul●水400ul2．在16℃過夜孵育。3．在70℃孵育30分鐘，使T4DNA連接酶變性。4．加1體積的乙醇并振蕩45秒，在14000g微離心機中離心10分鐘，然后將上清液轉移到另一新的微離心管中。5．加1體積的24/1（體積比）氯仿/異戊醇并振蕩45秒，在14000g微離心機中離心...
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